|
Prinzip der Klonierung - Referat
Prinzip der Klonierung
Ziel der Klonierung: Ziel des genetischen Klonierungsexperiments ist die Isolierung eines Gens aus einem Organismus (Mensch/Tier/Pflanze) und dessen Vermehrung in einem anderen, wie z.B. einem Bakterium. Zunächst wird dem Spenderorganismus genomische DANN entnommen und mit Hilfe der "molekularen Schere" in Fragmente zerlegt.
Isolierung der Plasmide: Parallel dazu werden aus E. coli-Bakterien Plasmide isoliert, die als Vektoren verwendet werden. Diese werden ebenfalls mit dem Restriktionsenzym an einer Stelle geöffnet. In die entstandene Lücke wird die DNA aus dem Spenderorganismus "eingeklebt". Als "molekularen Klebstoff", der Plasmid und Fremd-DNA miteinander verknüpft, nimmt man ein Enzym (DNA- Ligase), das in allen Lebewesen vorkommt.
Einschleusen der Empfängerzelle: Das so entstandene rekombinante Plasmid wird anschließend in E.coli-Bakterien als Empfängerzellen eingeschleust. Da nur ein Bruchteil der Bakterien ein rekombinantes Plasmid aufnimmt, muss ein Selektionschritt angeschlossen werden. Hierbei verwendet man häufig eine Antibiotikaresistenz, die auf dem Plasmid lokalisiert ist (Amp).
Vermehrung:Unter dem Einfluss des Antibiotikums können sich nur noch die "geimpften" Bakterien vermehren. Die von dem rekombinanten Bakterium abstammenden Bakterien sind genetisch identisch und werden als Klon bezeichnet.
Besitzt der verwendete Vektor die entsprechenden Regulationssequenzen für die Übersetzung des Gens, stellen die Klone das entsprechende Protein her. Die gentechnische Veränderung führt so zu einer Umprogrammierung des bakteriellen Stoffwechsels. Dieses Prinzip gilt nicht nur für die Klonierung von DNA in Bakterien, sondern gilt universell für alle Zellen. Unterschiede ergeben sich lediglich durch die Verwendung der Vektoren, die den entsprechenden Eigenschaften der Empfängerzelle angepasst sein müssen.
Beispiel:
Prinzip der Herstellung von Humaninsulin mit Hilfe gentechnisch veränderter Bakterien: Insulin ist ein Hormon, das von der Bauchspeicheldrüse zur Regulierung des Zuckerhaushalts im Körper gebildet wird. Für die gentechnische Herstellung wird die Erbinformation für das Insulin in Bakterien transferiert, deren Stoffwechsel so umprogrammiert werden muß, daß sie das Humaninsulin in großen Mengen produzieren.
Erstellen einer DNA-Bibliothek:Zunächst muß aus der Gesamtheit menschlicher Gene das Insulin-Gen isoliert werden. Um das Gen ausfindig zu machen, entnimmt man DNA , z. B. aus einer Gewebeprobe. Im Reagenzglas wird die DNA mit Hilfe des Restriktionsenzyms in kleine Teile zerlegt. Diese Teile werden zusammen mit einem Ampicillin-Resistenz-Gen in einen E.coli-Bakterienstamm eingeschleust.
Die folgende Selektion mit Ampicillin überleben nur die Bakterien, die ein rekombinantes Plasmid zusammen mit der Antibiotika-Resistenz aufgenommen haben.
Das menschliche Genom wird nun auf unzählige Bakterien verteilt. Diese Gesamtzahl der rekombinanten Bakterien bildet die DNA-Bibliothek. Ein Teil der Bakterien enthält das gesuchte Insulin-Gen.
Herstellen einer DNA-Sonde:Um das Insulin-Gen ausfindig zu machen, benötigt man einen geeigneten Detektor. Dazu muß die Abfolge der Proteinbausteine (Aminosäuren) im Insulin bestimmt werden. Die Aminosäuresequenz wird mit Hilfe des genetischen Codes in eine DNA-Sequenz zurückübersetzt. Mit der chemischen Synthetisierung eines kurzen Teils dieser ermittelten Sequenz erhält man die benötigte DNA-Sonde.
Identifizierung des Insulin-Gens
Die DNA-Sonde wird mit einem Farbstoff markiert. Verbindet sich die markierte DNA-Sonde mit ihrem komplementären Gegenstück, der Plasmid-DNA aus dem Bakterium mit dem Insulin-Gen, wird dieser Vorgang sichtbar. Damit der so gefundene Bakterienklon das Insulin-Protein in großen Mengen produzieren kann, wird ein sogenannter Expressionsvektor eingesetzt, der alle Regulationsinformationen für die Überproduktion von Insulin enthält.
Großtechnische Herstellung von Insulin
Um Insulin in großen Mengen zu erhalten, werden die rekombinanten Bakterien in großen Fermentern gezüchtet. Unter optimalen Bedingungen teilt sich eine Bakterienzelle alle 20 Minuten, nach 16 Stunden hat sie 300 Billionen "Nachkommen". Aus der Masse der abgetöteten Bakterien wird der Insulinvorläufer isoliert und gereinigt. Die Umwandlung in das fertige Humaninsulin erfolgt auf chemischem Weg.
Kommentare zum Referat Prinzip der Klonierung:
|
